Le esperienze cliniche, svolte negli ultimo ventennio, hanno dimostrato che le innumerevoli proprietà della gelatina reale sono quasi sempre legate all’azione della sua componente proteica.
Nel 1990 Fujiwara e colleghi. hanno scoperto nella gelatina reale una piccola proteina con potente azione antibatterica, a cui hanno dato il nome di Royalisina. La Royalisina è una proteina anfipatica (ha sia un gruppo idrofobo che uno idrofilo) di origine ignota che risulta essere composta da 51 residui, con carica netta +2. La peculiarità della sua struttura sta nell’alto contenuto di cisteina (6 residui) e di tre ponti disolfuro intramolecolari che possono conferire una struttura compatta esibendo elevata stabilità a pH basso e a temperature elevate. In base ai risultati emersi dallo studio sopracitato, la royalisina ha una spiccata attività antibatterica contro i batteri Gram positivi (tra cui Corynebacterium, Staphylococcus e Streptococcus), ma non contro i Gram negativi (Fujiwara et al., 1990; Bilikova et al. nel 2001)
Hanes e Simuth nel 1992 hanno isolato dalla gelatina reale le Major Royal Jelly Proteins (MRJP), un gruppo di proteine avente una massa molecolare di 57 kDa composto da almeno otto componenti con un punto isoelettrico con un range di pH compreso tra 4,5 e 5.
Nel 1998 Schmitzova et al., basandosi sugli studi effettuati da Hanes e Simuth, hanno identificato dei cinque tipi di MRJP denominati MRJP1, MRJP2, MRJP3, MRJP4 e MRJP5 e valutato la loro composizione amminoacidica.
La MRPJ 1 ha una massa molecolare di 46,8 kDa ed un residuo amminoacidico di 416, MRPJ 2 ha una massa molecolare di 48,9 kDa ed un residuo amminoacidico di 435, MRPJ 3 ha una massa molecolare di 59,5 kDa ed un residuo amminoacidico di 528, MRPJ 4 ha una massa molecolare di 50,9 kDa ed un residuo amminoacidico di 449 e MRPJ 5 ha una massa molecolare di 68,0 kDa ed un residuo amminoacidico di 581. Inoltre MRJP3 e MRJP 5 presentavano una struttura polimorfica.
Gli studi effettuati da Klaudiny et al. (1994), Kubo et al. (1996), Ohashi et al. (1997) hanno dimostrato che l’mRNA della MRJP1 è presente in quantità elevate nelle ghiandole ipofaringee sia di api nutrici che di api operaie, mentre MRJP2, MRJP3 e MRJP4 sono sintetizzati esclusivamente dalle ghiandole ipofaringee delle api nutrici.
Albert et al. nel 1999 hanno studiato e approfondito l’origine e l’evoluzione delle MRJP riportando che questa famiglia di proteine contenute nella gelatina reale presentano una origine simile a quella delle yellow proteins prodotte da Drosophila spp. ipotizzando che la varietà e lo sviluppo delle MRJP abbia facilitato la differenziazione di casta nell’ Apis mellifera.
Nel 2002 Bilikova et al. hanno studiato e caratterizzato un piccolo peptide, a cui è stato dato il nome di apisimina, scoperto dagli stessi nella gelatina reale e nella testa delle api nutrici che potrebbe giocare un ruolo fisiologico fondamentale nelle colonie di Apis mellifera. Dalle analisi è risultato che l’apisimina contiene otto cloni identici di cDNA, ed era formata da 54 amminoacidi, di cui il 18,5% di valina e il 16,7% di serina. L’apisimina non mostra alcuna somiglianza con le altre proteine presente sia nella gelatina reale, sia negli altri prodotti apistici, compreso il veleno d’api.
Esperimenti effettuati da Fontana et al. nel 2004 hanno individuato e classificato i peptidi antimicrobici presenti nella gelatina reale a cui hanno attribuito il nome di jelleine. Le jelleine sono un gruppo di quattro peptidi antimicrobici, di circa 1000 Da, che potrebbero essere il risultato della digestione delle apoalbumine (o MRJP) da parte di proteasi specifiche. Considerando la presenza di un residuo Arg in posizione 373 della sequenza primaria della MRJP1, seguito in posizione 374 dal residuo Thr, si può suppore che la jelleina II possa essere il prodotto della digestione con tripsina di MRJP-1 (prodotta dalle ghiandole ipofaringee e secreta nella gelatina reale). Un’azione di exoproteinasi sia su N-terminale che su C-terminale del frammento triptico potrebbe portare, rispettivamente, alla formazione delle jelleine I e IV.
Lo studio coordinato e condotto da Felicioli nel 2004 (Scarselli et al 2005), il primo condotto con approccio proteomico sulla gelatina reale, ha identificato e comparato le proteine della gelatina reale con quelle delle “corbiculette” di polline dimostrando che le stesse proteine secrete dall’ape operaia erano presenti sia nella gelatina reale che sulle corbiculette.
In allegato la tabella di identificazione delle proteine della gelatina reale (R) e del polline manipolato dalle api
Questo approccio proteomico ha permesso l’identificazione di due isoforme dell’apoalbumina 2 nella gelatina reale e la presenza dell’apalbumina 2 e dell’apalbumina 1 anche nel polline manipolato dalle api. La presenza di apalbumina 2 nel polline manipolato dalle api rafforza l’idea che anche questa proteina potrebbe svolgere un ruolo diverso da quello nutrizionale. L’analisi suggerisce anche che le due proteine identificate nello spot R10 sono i prodotti della degradazione dell’apalbumina 3; questo sarebbe il primo caso di rilevamento di frammentazione di una proteina diversa dall’apalbumina 1. Gli Spot numerati R11-R18 sono stati identificati come frammenti dell’apalbumina 1. La presenza di frammenti di apalbumina 1 e apalbumina 3 suggerisce un processo di degradazione a causa della attività di proteinasi.
Lo studio appena riportato è stato alla base delle successive indagini sulla gelatina reale, infatti,
Li et al. nel 2007 già ospite nel laboratorio di Felicioli e basandosi sugli studi effettuati da quest’ultimo e pubblicati nel 2005, hanno a loro volta effettuato l’analisi proteomica di tre diversi campioni di gelatina reale, prodotti rispettivamente da un ceppo di Apis mellifera L. selezionato artificialmente per circa due decenni per una maggiore proiezione, un ceppo italiano di Apis mellifera ligustica e un ceppo carnico di Apis mellifera carnica. I risultati hanno dimostrato che il numero rilevato di proteine sono significativamente maggiori nella gelatina reale del ceppo selezionato e del ceppo italiano rispetto a quello carnico. MRJP 1 è stato osservato in tutti e tre i campioni, mentre cinque macchie minori sono state mostrate nella gelatina reale del ceppo selezionata, sei macchie minori nel ceppo italiano e quattro macchie minori nel ceppo carnico; ciò dimostra che RJP 1 può presentare varianti probabilmente causati da diversi siti di glicosilazione (Santos et al., 2005). Per quanto riguardo MRJP 2 sono state classificati 11 diverse forme nel ceppo selezionato, 12 nel ceppo italiano e 10 nel ceppo carnico. 10 diverse forme di MRJP 3 sono stati identificati nel ceppo selezionato, 19 nel ceppo italiano e 18 nel ceppo carnico. MRJP 4, presenti in quattro forme diverse in tutti e tre i campioni, è stato identificato con difficoltà, probabilmente legato alle alte temperature di stoccaggio. Quattro diverse forme di MRJP 5 sono state determinate nella gelatina reale del ceppo selezionato e nel ceppo carnico, mentre solo tre di queste sono state identificate nel ceppo italiano. Tre diverse forme di glucoso ossidasi (GOX) sono state individuate nei tre campioni. GOX è utilizzato per la produzione biologica e per la rimozione di ossigeno o glucosio dagli alimenti per migliorare la capacità di conservazione e potrebbe contribuire all’azione antisettica della gelatina reale (Adler et al., 1985). Inoltre sono anche stati identificati perossiredossina, una grande famiglia di ossidasi in grado di ridurre il perossido di idrogeno (l’acqua ossigenata) ed idroperossidi alchilici (Chae et al.,1994; Rhee et al., 2001; Henkle et al., 2001; Fujii et al., 2002; Hofmann et al., 2002), e glutatione S-transferasi (GST S1), un gruppo di enzimi di disintossicazione per catalizzare la coniugazione di una gamma diversificata di composti elettrofili con glutatione (Hayes et al., 1995).
Le attività biologiche di PRDX e GST, eventualmente, possono contribuire in parte alla longevità delle regine e alla sorprendente capacità di deporre un tal numero di uova. Concludendo è possibile dire che tra il ceppo selezionato e il ceppo italiano non è stata dimostrata una significativa differenza proteica, mentre una notevole differenza rimane del confronto con il ceppo carnico.
Peixoto et al., nel 2009 hanno scoperto tre polipeptidi, denominati P57, P70 e P128, in specifici tessuti del cervello delle api. Dall’analisi proteomica è emesso che i tre polipeptidi sono correlati con proteine della famiglia MRJP, nello specifico P57 con MRJP1, P70 con MRJP3, mentre il P128 può essere un forma oligomerica o un nuovo polipeptide. L’immunostaining della ghiandola del cervello e ipofaringea ha rivelato una differente espressione delle MRJPs in varie regioni del cervello e in diverse caste di api e sotto caste. L’identificazione e la localizzazione delle MRJPs nelle regione celebrali suggeriscono un possibile coinvolgimento di questa famiglia proteica anche nello sviluppo del sistema nervoso delle api e nel differenziazione di casta.